Pruebas de diagnóstico para el nuevo coronavirus Covid-19

Lanzan tres pruebas de diagnóstico para el Covid-19

El grupo francés BioMérieux anunció el lanzamiento de tres pruebas diferentes de diagnóstico molecular en respuesta a la pandemia de Covid-19. Se trata de las siguientes pruebas de diagnóstico para el Covid-19:

1. ARGENE SARS-COV-2 R-GEN
2. BIOFIRE SARS-CoV-2
3. BIOFIRE RP2.1

Se trata de pruebas de PCR en tiempo real. Este panel está clínicamente validado en un tipo de muestra respiratoria. La prueba SARS-COV-2 R-GENE se presentó a la FDA y se autorizó para uso de emergencia. También se espera que obtenga la Marca CE en Europa. La compañía está desarrollando de manera simultánea una prueba totalmente automatizada basada en la tecnología BioFire Filmarray con el apoyo del Departamento de Defensa de Estados Unidos.

Esta prueba se ejecuta en plataformas Filmarray 2.0 y Filmarray Torch, destinadas a detectar Covid-19. A su vez, se está desarrollando el panel respiratorio Biofire (RP2.1), una versión ampliada de Biofire Filmarray Respiratory Panel 2.

Qué virus detecta el nuevo panel

El panel detectará el Covid-19 además de los otros 21 agentes patógenos respiratorios comunes. Cabe remarcar que se obtiene los resultados en aproximadamente 45 minutos. La prueba estará disponible en la plataforma Filmarray 2.0 y Filmarray Torch.  

El  director médico de BioMérieux, Mark Miller, sostiene que ante la urgencia de la epidemia de Covid-19, BioMérieux se compromete a proporcionar un enfoque de diagnóstico integral que cumpla con los más altos estándares de rendimiento y calidad para ayudar a los médicos a dar una respuesta efectiva al brote.

La prueba ARGENE SARS-COV-2 R-GENE se producirá en Verniolle, Francia. Mientras que las pruebas BIOFIRE SARS-CoV-2 y BIOFIRE RP2.1 se desarrollarán en Estados Unidos.

Importancia del diagnóstico para la salud pública

Entre las principales prioridades para facilitar las intervenciones de salud pública se encuentra el diagnóstico confiable de laboratorio. En una infección respiratoria aguda, la prueba RT-PCR se usa habitualmente para detectar virus causales de secreciones respiratorias. Diversos estudios han demostrado la viabilidad de introducir tecnología robusta de detección basada en RT-PCR en tiempo real en laboratorios de salud pública durante emergencias sanitarias internacionales. Esto normalmente se realiza mediante la coordinación entre laboratorios públicos y académicos. En estas situaciones, los virus aislados estaban disponibles como fundamento para establecer y controlar las pruebas y su rendimiento.

Sin embargo las pruebas de diagnóstico para el Covid-19 presentaron un desafío especial. En el caso del nuevo coronavirus 2019-nCoV, los virus aislados o muestras de virus de pacientes infectados hasta ahora no están disponibles para la comunidad científica internacional. Por lo tanto tuvo que ser diferente el establecimiento y la validación de un flujo de trabajo de diagnóstico para el cribado del Covid-19 y la confirmación específica. Esto porque se diseñó en ausencia de virus aislados disponibles o muestras de pacientes originales. El diseño y la validación fueron habilitados por la estrecha relación genética con el SARS-CoV de 2003 y con ayuda de tecnología de ácido nucleico sintético.

El proceso diagnóstico del nuevo coronavirus: el caso del 2019-nCoV

Antes del lanzamiento público de las secuencias de virus de los casos del 2019-nCoV, se hablaba de un virus similar al SARS. Por lo tanto, se asumió que un CoV relacionado con el SARS estaba involucrado en el brote. Se descargó todas las secuencias de virus completas y parciales (si> 400 nt) relacionadas con el SARS disponibles en GenBank antes del 1 de enero de 2020. La lista de secuencias artificiales (n = 729 entradas derivadas de laboratorio, sintéticas, etc.) se verificó manualmente y se eliminó los duplicados. Se obtuvo como resultado una lista final de 375 secuencias. La alineación de estas secuencias se usó para el diseño del ensayo.

Tras el lanzamiento de la primera secuencia del 2019-nCoV en virological.org, se seleccionó tres ensayos en función de qué tan bien coincidían con el genoma 2019-nCoV. La alineación se complementó con secuencias adicionales liberadas independientemente en GISAID (https://www.gisaid.org), lo que confirma la buena coincidencia de los cebadores seleccionados con todas las secuencias. GISAID es la Iniciativa Mundial para Compartir todos los Datos de Influenza.

Desarrollo de las pruebas de diagnóstico para el Covid-19

Las pruebas de diagnóstico para el Covid-19 se desarrolló con base en la sensibilidad basada en viriones de coronavirus del SARS. Un virión es la forma completa e infectiva de un virus fuera de una célula que lo hospeda. El virión contiene un núcleo de ADN, ARN y una cáspide vírica. Para obtener una evaluación preliminar de la sensibilidad analítica, se utilizó un sobrenadante de cultivo celular purificado que contiene viriones Frankfurt-1 de la cepa SARS-CoV cultivados en células Vero. El sobrenadante se ultrafiltró y, por lo tanto, se concentró a partir de un volumen de aproximadamente 20 veces de sobrenadante de cultivo celular.

La etapa de concentración reduce simultáneamente la concentración relativa de los ácidos nucleicos de fondo, como el ARN viral no empaquetado con viriones. La preparación del virión se cuantificó por RT-PCR en tiempo real usando un estándar de cuantificación de ARN transcrito in vitro específico. Todos los ensayos fueron sometidos a pruebas replicadas para determinar las frecuencias de detección estocástica en el punto final de sensibilidad de cada ensayo.

Estos dos ensayos fueron elegidos para una evaluación adicional. Uno de los laboratorios que participaron en la evaluación externa utilizó otros reactivos de RT-PCR básicos y repitió el estudio de sensibilidad, con resultados equivalentes (gen E: 3.2 copias de ARN / reacción (IC 95%: 2.2 –6.8).

Detección del Covid-19 a partir de la prueba PCR en tiempo real

Para el análisis del virus se hizo un estudio de sensibilidad basada en ARN transcrito in vitro. Los ensayos detectaron 2019-nCoV sin polimorfismos en los sitios de unión de oligonucleótidos. Se generó estándares de ARN transcritos in vitro que coincidían exactamente con la secuencia de 2019-nCoV para la cuantificación absoluta y el estudio del límite de detección (LOD). Las reacciones replicadas se realizó a concentraciones alrededor del punto final de detección determinado en experimentos preliminares de dilución. La LOD resultante de las pruebas repetidas fue de 3.9 copias por reacción para el ensayo del gen E y 3.6 copias por reacción para el ensayo de RdRp. Estas cifras fueron cercanas al índice de acierto del 95% de 2.9 copias por reacción, de acuerdo con la distribución de Poisson, esperada cuando se detecta una molécula de ARN.

De esta manera se logró discriminar el Covid-19 del coronavirus del SARS por medio del ensayo de RdRp. Siguiendo la lógica de que el ARN del SARS-CoV puede usarse como un control positivo para todo el procedimiento de laboratorio, evitando así la necesidad de manejar el ARN del nCovid-19. Se formuló  el ensayo RdRp para que contuviera dos sondas: una sonda de rango amplio que reacciona con SARS-CoV y 2019-nCoV, y una sonda adicional que reacciona solo con Covid-19. Al limitar los experimentos de dilución, se confirmó que ambas sondas, si se usa individualmente o en combinación, proporcionan la misma LOD para cada virus objetivo. La sonda específica RdRP_SARSr-P2 detectó solo la transcripción de ARN de 2019-nCoV pero no el ARN de SARS-CoV.

Prueba de especificidad: reactividad cruzada con otros coronavirus

Para excluir la reactividad no específica de los oligonucleótidos entre sí, causando señales fluorescentes artificiales, se probó todos los ensayos 120 veces. Se realizó en paralelo con agua y ningún otro ácido nucleico, excepto los oligonucleótidos proporcionados. En ninguna de estas reacciones se detectó ninguna señal positiva.

Los sobrenadantes de cultivo celular que contienen todos los coronavirus humanos endémicos (HCoV) -229E, -NL63, -OC43 y -HKU1, así como MERS-CoV, se probó por duplicado en los tres ensayos. Para el HCoV-HKU1 no cultivable, se usó el sobrenadante del cultivo de la vía aérea humana. La concentración de ARN viral en todas las muestras se determinó mediante RT-PCR específicas en tiempo real. Así como estándares de ARN transcritos in vitro diseñados para la cuantificación absoluta de la carga viral. Se analizó sobrenadantes de cultivo celular adicionales no diluidos (pero no cuantificados). Estos fueron mezclados adicionalmente en muestras negativas de esputo humano. Ninguno de los virus o preparaciones de virus probados mostró reactividad con ningún ensayo.

Beneficios de la prueba RT-PCR en tiempo real

La RT-PCR en tiempo real se utiliza ampliamente en virología diagnóstica. En el caso de una emergencia de salud pública, se puede confiar en esta tecnología para establecer nuevas pruebas de diagnóstico dentro de sus servicios de rutina antes de que los ensayos preformulados estén disponibles.

Además de la información sobre reactivos, oligonucleótidos y controles positivos, los laboratorios que trabajan bajo programas de control de calidad deben confiar en la documentación de la calificación técnica de la formulación de la prueba, así como en los datos de las pruebas de evaluación clínica externa. La provisión de plantillas de ARN de control se implementó de manera exitosa por el proyecto EVAg. Este es un proyecto que proporciona reactivos relacionados con virus de colecciones de investigación académica.

El ARN del SARS-CoV era recuperable en EVAg antes del brote actual. Ciertos productos específicos, como transcripciones de ARN para los ensayos descritos aquí, se pudo recuperar por primera vez del catálogo en línea de EVAg el 14 de enero de 2020  a través de su sitio web (https://www.european-virus-archive.com).

Conclusiones

Las pruebas de diagnóstico para el Covid-19 en ausencia de fuentes físicas de ácido nucleico genómico viral representaron un gran reto. Se realizó a partir del establecimiento de un flujo de trabajo de diagnóstico para la detección del virus. El diseño efectivo de los ensayos fue posible gracias a la voluntad de los científicos de China de compartir información sobre el genoma. También debido a la disponibilidad de un amplio conocimiento de secuencia de aproximadamente 15 años de investigación de virus relacionados con el SARS en reservorios animales. La relativa facilidad con la que se diseñó ensayos de pruebas para este virus, en contraste con el SARS-CoV en 2003, demuestra el enorme valor colectivo de los estudios descriptivos de la ecología de la enfermedad y la diversidad del genoma viral.

Los datos de calificación técnica basados ​​en materiales de cultivo celular y construcciones sintéticas, así como los resultados de las pruebas de exclusividad en 75 muestras clínicas, se incluyó en la primera versión del protocolo de diagnóstico proporcionado a la Organización Mundial de la Salud el 13 de enero de 2020. Los estudios de evaluación comparables durante la calificación reglamentaria de los ensayos de diagnóstico in vitro pueden llevar meses para la organización, implementación legal y logística. Por ello generalmente están disponibles después de que el pico de un brote ha disminuido.

Sin embargo, la velocidad y eficacia del presente despliegue y el esfuerzo de evaluación fueron permitidas por las redes de investigación internacionales establecidas en respuesta a las crisis sanitarias mundiales de los últimos años. Esto demuestra la enorme capacidad de respuesta que se puede lograr a través de la acción coordinada de laboratorios académicos y públicos. Esta capacidad de laboratorio permite a los sitios recibir pacientes durante las respuestas rápidas de investigación clínica.

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Fuentes

Corman, V. et al. (2020). Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. 18 de marzo de 2020, de US National Library of Medicine National Institutes of Health Sitio web: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/  

Veredict Medical Devices. (2020). Covid-19: BioMérieux launches three coronavirus tests. 18 de marzo de 2020, de Veredict Medical Devices Sitio web: https://www.medicaldevice-network.com/news/biomerieux-coronavirus-tests/ 

Molteni, M. & Rogers, A. (2020). Everything You Need to Know About Coronavirus Testing. 18 de marzo de 2020, de Wired Sitio web: https://www.wired.com/story/everything-you-need-to-know-about-coronavirus-testing/