Diagnóstico de la fiebre amarilla: biología molecular de una enfermedad infecciosa reemergente

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Fiebre amarilla: una enfermedad infecciosa reemergente

La fiebre amarilla es una infección viral hemorrágica transmitida por la picadura de mosquitos que ocurre en humanos y en primates. Es conocida también como fiebre biliosa, vómito negro, thyfus amarillo, peste biliosa y fiebre de la jungla. Se le conoce como “fiebre amarilla” porque un signo común de la enfermedad es la piel color amarillo debido a ictericia. Si bien cualquier persona puede contraer la fiebre amarilla, las personas de la tercera edad y los niños tienen mayor riesgo de presentar una enfermedad grave. Este artículo explica el diagnóstico de la fiebre amarilla, en particular, el diagnóstico molecular.

Los síntomas de la fiebre amarilla son fiebre, mialgias con dolor de espalda intenso, cefaleas, escalofríos, pérdida de apetito, cansancio y náusea o vómito. Un pequeño número de pacientes infectados presentan síntomas graves conocidos como periodo de intoxicación.  En este predominan síntomas de insuficiencia hepática e insuficiencia renal, ictericia y manifestaciones hemorrágicas. Los casos que llegan a este periodo tienen el 50% de probabilidad de mortalidad con desenlace entre el séptimo y décimo día.

El virus de la fiebre amarilla es endémico de las zonas tropicales de África y de América Central y Sudamérica.

Diagnóstico de la fiebre amarilla: infección viral hemorrágica

“Entre enero de 2017 y diciembre de 2018, seis países del continente americano notificaron casos confirmados de fiebre amarilla. Estos fueron Bolivia, Brasil, Colombia, Ecuador, Guayana Francesa y Perú. Los casos notificados en ese periodo en la Región de las Américas superaron lo registrado en varias décadas”.

Diagnóstico de la fiebre amarilla

En los hospitales el diagnóstico de la fiebre amarilla está basado en pruebas de laboratorio, la sintomatología del paciente y su historial de viaje. No obstante, aún con la historia clínica y datos epidemiológicos es difícil realizar el diagnóstico de la fiebre amarilla.

A los pacientes con sospecha de fiebre amarilla se les debe solicitar los siguientes exámenes de laboratorio que facilitan el diagnóstico de causa y de gravedad:

  • Hemograma (con plaquetas)
  • Hepatograma (GOT, GPT, bilirrubina)
  • Función renal (creatinina, urea)

Diagnóstico de la fiebre amarilla: Inmunohistoquímica y Neutralización por reducción de placas

Técnicas para el diagnóstico de la fiebre amarilla

Se debe sospechar fiebre amarilla cuando se presenta fiebre al menos durante siete días. También si la fiebre va acompañada de mialgias o cefalea, sin afección de las vías aéreas superiores y sin etiología definida procedente de área de riesgo para fiebre amarilla. Asimismo, se debe sospechar de a enfermedad si hay ocurrencia de casos de fiebre amarilla sin vacuna antiamarílica previa. El cuadro es más sospechoso aún en presencia de ictericia, signos de sangrado o insuficiencia renal.

La confirmación del diagnóstico de la fiebre amarilla se hace por alguna de las siguientes técnicas y depende del inicio de los síntomas y la toma de la muestra:

  • Diagnóstico virológico: aislamiento del virus de la fiebre amarilla,  inmunohistoquímica o diagnóstico molecular
  • Diagnóstico serológico: detección de inmunoglobulina M (IgM) o neutralización por reducción en placas    (PRNT)

Si la muestra fue tomada durante los primeros 10 días desde el inicio de los síntomas (fase virémica) puede realizarse alguno de los diagnósticos virológicos mencionados. Por otro lado, si la muestra fue tomada en la fase post-virémica (a parir del sexto día), debe realizarse el diagnóstico serológico.

Diagnóstico molecular de la fiebre amarilla

El diagnóstico molecular de la fiebre amarilla se realiza a partir de una muestra del suero del paciente en fase virémica, que cumpla con la sintomatología característica de la enfermedad. Su principal objetivo es identificar fragmentos de material genético específicos del virus.

Actualmente el diagnóstico de la fiebre amarilla y su vigilancia epidemiológica se realiza mediante RT-qPCR en tiempo real. Esta es una variante de la PCR en la cual partiendo del ARN del virus previamente extraído, primeramente se lleva a cabo un paso de retrotranscripción (RT). Es decir, el ARN es convertido a ADN complementario (ADNc) y posteriormente el ADNc es amplificado para obtener una gran cantidad de copias especificas del virus.

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La amplificación es monitoreada mediante captación de señales de fluorescencia que son colectadas ciclo por ciclo; desde el primero, hasta el último ciclo de la PCR. Por tal motivo lleva el nombre de PCR en tiempo real, ya que permite ver el progreso de la amplificación del virus de la fiebre amarilla en directo.

Diagnóstico de la fiebre amarilla: PCR múltiple

“La PCR es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis que permite la síntesis in vitro de secuencias específicas de ADN”.

Diagnóstico de la fiebre amarilla por PCR en tiempo real

Para el diagnóstico molecular de la fiebre amarilla por PCR en tiempo real se necesita forzosamente cebadores o primers. Estos son fragmentos de ADN que sirven como punto de partida para la replicación y además, son específicos para detectar el virus en cuestión. También se requiere de una sonda marcada con fluorescencia que permite observar el progreso de la amplificación. Finalmente, se necesita una enzima retrotranscriptasa, la cual es capaz de convirtir el ARN del virus en ADNc, y una enzima polimerasa, que produce la cadena complementaria del material genético buscado (templado).

Estos componentes deben ir en una solución reguladora “buffer” que contiene sales que son sustrato de la polimerasa y oligonucleótidos necesarios para la elongación de la hebra complementaria. A ésta combinación se le llama “mezcla de reacción” que se dispensa en tubos de reacción junto con el ARN extraído. Posteriormente, se coloca en un termociclador con modulo óptico para llevar a cabo la RT-PCR en tiempo real.

Los valores de la amplificación se expresa en valores de Ct (del inglés Cycle Threshold). Este es el ciclo en el cual la producción de fluorescencia cruza el umbral establecido y se mide en valores de fluorescencia relativa (UFR).

Diagnóstico de la fiebre amarilla: vacuna contra la fiebre amarilla

Resultados de la RT-PCR para el diagnóstico de fiebre amarilla

Los posibles resultados obtenidos al finalizar el proceso (haciendo uso de los controles e interpretación adecuados), son los siguientes :

  • Positivo: curva sigmoide con valor de Ct ≤ 35
  • Negativo: curva sigmoide con valor Ct ≥ 39
  • Muestra inadecuada: la muestra no fue tomada adecuadamente

El diagnóstico molecular ofrece una alta sensibilidad, especificidad y rapidez con mínimos requerimientos de muestra, en comparación con las técnicas de diagnóstico serológico e inmunohistoquímico.

Aunque México no se considera un país endémico, el escenario epidemiológico actual de la fiebre amarilla por los brotes en Brasil, obliga a estar preparados ante un posible resurgimiento de la enfermedad en la frontera. No existe tratamiento antiviral para la fiebre amarilla. Sin embargo, la vacunación es la medida preventiva más importante. Una sola dosis confiere protección de por vida.

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Fuentes

Secretaría de salud. (2017). LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DEL DENGUE Y OTRAS ARBOVIROSIS. 2017, de Dirección general de epidemiología, InDRE Sitio web: https://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/269560/Actualizados_Lineamientos_Dengue_y_otros_Arb_V2.pdf

OPS/OMS. (2019). Actualización Epidemiológica Fiebre amarilla. 2019, de OPS/OMS Sitio web: https://www.paho.org/hq/index.php?option=com_docman&view=download&category_slug=fiebre-amarilla-2178&alias=47623-25-de-enero-de-2019-fiebre-amarilla-actualizacion-epidemiologica&Itemid=270&lang=es

OPS/OMS. (2018). Diagnóstico por laboratorio de la infección por Virus de la Fiebre Amarilla. 2018, de OPS/OMS Sitio web: https://www.paho.org/hq/index.php?option=com_docman&view=download&category_slug=guias-7134&alias=46875-diagnostico-por-laboratorio-de-la-infeccion-por-virus-de-la-fiebre-amarilla&Itemid=270&lang=es

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