Diagnóstico del dengue por biología molecular: un ensayo exacto y avanzado

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Diagnóstico del dengue

El dengue es una infección viral transmitida por mosquitos que causa una enfermedad grave. El diagnóstico del dengue puede realizarse mediante métodos serológicos o moleculares. Para ambas pruebas se necesita una muestra de suero sanguíneo del paciente que se obtiene a través de punción venosa y centrifugación. El método serológico se puede realizar en la fase aguda (cero a cinco días de evolución) y en la fase convaleciente (seis a 10 días de evolución).

Sin embargo, se ha comprobado que el diagnóstico de dengue por métodos serológicos no es específico. Esto porque los anticuerpos que se utiliza para el diagnóstico pueden tener reacciones cruzadas con otras proteínas, emitiendo resultados positivos falsos.

La incidencia del dengue se ha multiplicado por 30 en los últimos 50 años. Se estima que al año se producen entre 50 y 100 millones de infecciones en más de 100 países endémicos. Esto pone en riesgo a casi la mitad de la población mundial.

Qué es el diagnóstico molecular

El diagnóstico molecular engloba un conjunto de técnicas de laboratorio que tienen como objetivo principal extraer, identificar y amplificar fragmentos de material genético, ADN y ARN. Estas técnicas se han convertido en una herramienta poderosa para detectar un sinfín de enfermedades: desde trastornos genéticos hasta infecciosos. Incluso el diagnóstico molecular ha sido utilizado para la identificación de personas. Esta detección parte del hecho de que la molécula de ADN es única para cada individuo y específica de género y especie. Por lo tanto, este atributo ha permitido implementar técnicas de extracción de material genético y de amplificación para identificar regiones de ADN específicas de microorganismos en muestras clínicas.

El diagnóstico del dengue por este método se realiza durante la fase aguda de la infección. El método es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Este método detecta el material genético del virus (ARN), que previamente fue extraído.

La PCR es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis. Esta técnica permite la síntesis in vitro de secuencias específicas de ADN.

Diagnóstico del virus del dengue: biología molecular

Diagnóstico del dengue y PCR múltiple

Actualmente el diagnóstico de dengue y su vigilancia epidemiológica se realiza en tiempo real mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-qPCR). Esta es una variante de la PCR en la cual primero se lleva a cabo un paso de retrotranscripción (RT), donde el ARN se convierte a ADN complementario (cADN) y posteriormente el cADN se amplifica para obtener una gran cantidad de copias especificas del virus.

El progreso de la amplificación se sigue ciclo por ciclo y los datos son colectados desde los primeros ciclos de reacción hasta el último. Por lo tanto, permite ver la amplificación en tiempo real (ciclo por ciclo) del material genético del virus dengue.

La detección de la amplificación del material genético es específica y monitoreada mediante la captación de señales de fluorescencia emitida durante los ciclos de la PCR. La presencia de altas concentraciones de material genético evidencia un incremento en la fluorescencia en los primeros ciclos de la reacción. Por el contrario, bajas concentraciones permiten obtener un incremento de fluorescencia en los últimos ciclos de amplificación.

Para el diagnóstico del dengue se debe saber que existen cuatro serotipos circulantes del virus: dengue 1, dengue 2, dengue 3 y dengue 4. A pesar de ser genéticamente muy parecidos, presentan pequeños cambios en ARN. Esto permite identificarlos molecularmente mediante una PCR múltiple.

La PCR múltiple es otra variante de la PCR que detecta material genético de dos o más cepas de microorganismos en una sola prueba. En conclusión, el diagnóstico del dengue o el diagnóstico molecular del dengue se realiza mediante una RT-qPCR múltiple en tiempo real.

Diagnóstico del dengue mediante RT-PCR múltiple

Para el diagnostico de dengue por RT-PCR múltiple es necesario:

1. ARN del virus del dengue extraído de muestras clínicas de pacientes en la fase aguda de la infección
2. Cebadores: fragmentos de ADN que sirven como punto de partida para la replicación y que son específicos para detectar el virus del dengue
3. Enzima retrotranscriptasa, que convierte el ARN en cADN
4. Enzima polimerasa, que produce la cadena complementaria del material genético buscado (templado)
5. Buffer, que contiene sales que estabilizan la mezcla de reacción y son sustrato de la polimerasa
6. Cuatro sondas marcadas con fluorescencia para cada uno de los cuatro serotipos de dengue, que permitirán observar la amplificación ciclo por ciclo
7. Termociclador, equipo con capacidad de calentar y enfriar rápidamente

Diagnóstico del dengue: PCR múltiple, termociclador

Todos estos reactivos conforman una mezcla de reacción que se coloca en el termociclador para llevar a cabo la PCR. Este proceso consiste en una serie de cambios de temperatura (ciclos) que se repite hasta 45 veces y consiste principalmente en tres etapas:

  • Desnaturalización del material genético (95°C)
  • Alineación de los cebadores (50°)
  • Extensión, donde se genera la cadena complementaria o templado (70°)

Para la PCR en tiempo real es necesario contar con un módulo óptico. Este proyecta sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y detecta la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado que está en la sonda.

Cómo se observa los resultados

Los valores de amplificación se expresa en valores de Ct (del inglés Cycle Threshold). Un Ct es el ciclo a partir del cual los valores de fluorescencia relativa (UFR) rebasan el punto de corte o umbral. El valor del Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ARN o ADN. La amplificación se observa como una curva sigmoide y se interpreta de la siguiente manera:

• Muestra con valor de Ct ≤ 35: positivo  (se identifica el serotipo o serotipos)
• Muestra con valor Ct ≥: 39: negativo

Es importante mencionar que el diagnóstico molecular ofrece una alta sensibilidad, especificidad y rapidez con mínimos requerimientos de muestra. Esto en comparación con las técnicas de diagnóstico clínico convencionales.

Por M. en C. Cristina Isabel Valenzuela Ponce

Fuentes

Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. (2013). Ensayo de RT-PCR en tiempo real para DENV-1-4 de los CDC. 05-01-2013, de CDC Sitio web: https://www.cdc.gov/dengue/resources/rt-pcr/CDCPackageInsert-spanish.pdf

Dirección general de epidemiología. (2018). Panorama Epidemiológico de Dengue 2018. 2018, de Secretaría de salud Sitio web: https://www.gob.mx/salud/acciones-y-programas/panorama-epidemiologico-de-dengue-2018

Chien LJ, Liao TL, Shu PY, Huang JH, Gubler DJ, Chang GJ. (2006). Development of real-time reverse transcriptase PCR assays to detect and serotype dengue viruses. Journal of clinical microbiology, 44(4), 1295-304.

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