Diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas: un hito en el diagnóstico clínico

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Diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas

Las enfermedades infecciosas constituyen un grave problema de salud pública a nivel mundial. Su prevención, control, diagnóstico, tratamiento y epidemiología han representado un reto significativo para la investigación biomédica a lo largo de la historia. En este artículo explicamos los métodos actualmente disponibles para el diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas.

Los métodos microbiológicos utilizados para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, son laboriosos y consumen mucho tiempo. Esta situación, aunada a la demanda por resultados inmediatos y a los avances tecnológicos, ha conducido a la aplicación de métodos moleculares para el diagnóstico.

El diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas se ha vuelto un hito y los métodos moleculares son importantes para el diagnóstico de muchas enfermedades, no solo de las de tipo infeccioso.  Esto porque las técnicas para el diagnóstico molecular han pasado de ser una metodología de difícil manejo y estandarización, a ser una técnica prometedora y de gran utilidad en los laboratorios clínicos.

Diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas

El diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas engloba un conjunto de técnicas que tienen como objetivo identificar moléculas de material genético (ADN y ARN) y proteínas. La detección y cuantificación de secuencias específicas de ADN o ARN de microorganismos a partir de muestras clínicas, ha convertido al diagnóstico molecular en una herramienta poderosa. Esto debido a que ofrece una alta sensibilidad, especificidad y rapidez con mínimos requerimientos de muestra en comparación con las técnicas de diagnóstico clínico convencionales.

Métodos para el diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas

Reacción en cadena de la polimerasa: PCR

La PCR es una técnica que permite amplificar exponencialmente el número de copias de un fragmento de ADN. Para poder lograr esta amplificación se requiere conocer la secuencia (o parte de la secuencia) del fragmento que se quiere amplificar. También son necesarios primers o cebadores que se unirán de manera complementaria al fragmento o secuencia buscada. Asimismo, se requiere una enzima termoestable, capaz de resistir temperaturas de 95°. Finalmente, sustratos para dicha enzima como cloruro de magnesio y oligonucleótidos, considerados como los “bloques” necesarios para la formación de la cadena complementaria.

“La importancia del descubrimiento de la PCR fue reconocido en 1993 por el Comité del Premio Nobel, el cual otorgó al doctor Kary Mullis por este hallazgo, el más alto reconocimiento que existe en el mundo científico.”

Todos estos reactivos mencionados conforman una mezcla de reacción que se coloca en el termociclador para llevar a cabo la PCR. Este proceso consiste en una serie de cambios de temperatura llamados ciclos, que se repiten hasta 45 veces. Estos ciclos consisten principalmente en tres etapas: desnaturalización del material genético (95°C), alineamiento de los cebadores (50°) y extensión (70°), donde se genera la cadena completaria del templado.

Diagnóstico molecular: ciclos de la PCR

Visualización de la muestra amplificada: electroforesis en gel y bromuro de etidio

La visualización de la muestra amplificada se puede lograr de varias maneras. Lo más fácil y económico es el corrimiento de la muestra por electroforesis en gel de agarosa y posteriormente teñir el gel con bromuro de etidio. El bromuro de etidio es un compuesto que se intercala en las moléculas de ADN y que emite luz al exponerse a la luz ultravioleta. De esta manera evidencia la amplificación de los fragmentos buscados.

“Como el bromuro de etidio se intercala en el ADN, esta sustancia tiene un poderoso efecto mutagénico y posiblemente cancerígeno o teratógeno. Actualmente existen otros compuestos que cumplen con la función del bromuro de etidio pero que no tienen efecto mutagénico”.

Los fragmentos amplificados tienen un peso molecular definido que se puede identificar con la ayuda de un marcador de peso molecular. Este se corre al mismo tiempo que los amplificados en la electroforesis en gel de agarosa.

La electroforesis en gel es una técnica que permite la separación de fragmentos de ADN por peso molecular. Esto ocurre mediante la acción de un campo eléctrico donde las moléculas de ADN cargadas negativamente (debido a la presencia de grupos fosfato) migran hacia el electrodo con carga positiva a través del gel que actúa como una red- Los fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes.

Diagnóstico molecular: electroforesis en gel

Electroforesis en gel

Desde su invención, se han descrito varias variantes de la PCR que han optimizado el diagnóstico clínico. A continuación se detallan las más utilizadas:

RT-PCR

La RT-PCR es una variante de la PCR que se utiliza para amplificar microorganismos de ARN. En esta técnica primeramente se lleva a cabo un paso de retrotranscripción (RT), donde el ARN es convertido a ADN complementario (ADNc) y posteriormente el ADNc es amplificado para obtener una gran cantidad de fragmentos específicos mediante una PCR convencional. En la RT-PCR la retrotranscripción sucede gracias a la acción de una enzima llamada retrotranscriptasa inversa.

Los fragmentos pueden visualizarse mediante electroforesis en gel de agarosa o puede utilizarse otra variante de la PCR conocida como PCR en tiempo real.

PCR en tiempo real.

En la PCR cuantitativa (qPCR) es utilizada para amplificar los fragmentos de ADN y cuantificar de manera simultánea los fragmentos amplificados. En esta variante se emplean los mismos pasos que una PCR convencional. La diferencia consiste en la mezcla de reacción a la que se le agrega un fluoróforo que se une al ADN bicatenario o una sonda marcada fluorescentemente. Este sistema permite observar el progreso de la amplificación mediante la excitación y emisión de luz y su posterior captación por un sistema óptico integrado al termociclador.

“Una sonda es un fragmento de ADN o ARN que se utiliza para detectar la presencia de secuencias complementarias a la secuencia de dicha sonda”

Las señales de fluorescencia son colectadas ciclo por ciclo desde el primer hasta el último ciclo de la PCR. Por esta razón lleva el nombre de PCR en “tiempo real”, ya que permite ver el progreso de la amplificación en directo. Este sistema evita el uso de la electroforesis en gel y del bromuro de etidio para la visualización de los fragmentos amplificados. Es especialmente relevante que esta variante se puede combinar con la RT-PCR.

Diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas: termociclador para PCR múltiplex

PCR-Múltiplex

La PCR multiplex permite detectar el material genético (ADN o ARN) de múltiples microorganismos en una misma mezcla de reacción de manera simultánea. Puede acoplarse con las variantes RT-PCR y qPCR.

Actualmente existen plataformas comerciales disponibles que contienen los componentes de la mezcla de reacción listos para su uso. Como resultado, se optimiza el proceso de preparación. Estas plataformas incluyen al FilmArray.

El FilmArray es un sistema de PCR multiplex certificado que integra la preparación, amplificación, detección y análisis de muestras. Este sencillo sistema sólo requiere 2 minutos de manipulación con resultados en una hora. Por lo tanto, se favorece a los pacientes al brindar un mejor tratamiento.

El sistema FilmArray permite realizar pruebas simultáneas para bacterias, virus, levaduras, parásitos o genes de resistencia a antibióticos. Está diseñado para utilizarse con paneles que analizan los grupos de patógenos más comunes que causan síntomas similares y que están asociados con brotes.

Conclusiones

El control de enfermedades infecciosas necesita el diseño de técnicas de diagnóstico molecular sensibles y específicas. Además, estas técnicas deben proporcionar resultados en un periodo de tiempo corto. Con el diagnóstico correcto se puede iniciar el tratamiento adecuado para el paciente.

Estas técnicas para el diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas son empleadas con mayor frecuencia por los laboratorios de referencias. Sin embargo, suelen quedar fuera de la oferta de muchos laboratorios de microbiología clínica.

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Fuentes

Alejandro Sweet-Cordero, José Ignacio Santos-Preciado. (2007). Avances en el diagnóstico molecular de las enfermedades infecciosas y parasitarias. 2007, de Gaceta médica de México Sitio web: http://www.anmm.org.mx/bgmm/1864_2007/1997-133-SUP1-111-124.pdf

Q. MAURICIO J. FARFÁN PhD. (2015). BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADA AL DIAGNÓSTICO CLÍNICO. 2015, de Revista Médica Clínica Las Condes Sitio web: https://www.researchgate.net/publication/289997025

Biomérieux. (2018). Sistema PCR multiplex FilmArray. 2018, de Biomérieux Sitio web: https://www.biomerieux.com.mx/diagnostico-clinico/productos/sistema-pcr-multiplex-filmarrayr

F. CLAVERIE MARTÍN, E. RAMOS TRUJILLO, F.J. GONZÁLEZ PAREDES2008. (2008). Técnicas para el diagnóstico molecular de enfermedades hereditarias. 2008, de Boletín de pediatría Sitio web: https://www.sccalp.org/documents/0000/0154/BolPediatr2008_48_235-241.pdf

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