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Diagnóstico molecular de la Influenza
La influenza también conocida como “gripe” es una enfermedad respiratoria contagiosa provocada por el virus de la influenza. Es diferente al resfriado común y puede causar una enfermedad leve o grave que en ocasiones puede llevar a la muerte. Este artículo ofrece información práctica sobre el diagnóstico molecular de la influenza.
“Los síntomas más comunes de influenza son fiebre (en ocasiones con escalofríos), tos, dolor de garganta, congestión nasal, dolores musculares, dolor de cabeza, fatiga y en algunos casos vómito y diarrea (común en niños)”
Existen dos tipos de virus de influenza: A y B. Los virus de influenza A y B por lo general se diseminan entre las personas (virus de influenza humana). Esto ocurre todos los años y puede causar epidemias de influenza estacional. Los virus de influenza tipo A pueden dividirse en diferentes subtipos según los genes que constituyen las proteínas de superficie. Durante el transcurso de la temporada de influenza hay circulación de los diferentes tipos (A y B) y subtipos (influenza A) que provocan enfermedades.
“La actual temporada de influenza 2018-2019 muestra un repunte de esa enfermedad infecto-contagiosa. Hasta el 28 de diciembre pasado sumaba mil 662 casos y 116 defunciones, cifras que contrastan con el periodo 2017-2018, con 861 casos y 25 defunciones. Esto según datos publicados por el Informe Semanal de Vigilancia Epidemiológica de la Dirección General de Epidemiología de la Secretaría de Salud”.
Diagnóstico molecular de la influenza: ensayo rápido y específico
Existe varias formas de realizar el diagnóstico de influenza. Sin embargo, las pruebas moleculares son más sensibles y de mayor rapidez.
Una prueba para el diagnóstico molecular de la influenza es la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Esta prueba puede detectar el ARN viral de la influenza en muestras clínicas con alta sensibilidad y especificidad.
En este ensayo primeramente se lleva a cabo un paso de retrotranscripción (RT). El ARN es convertido a ADN complementario (cADN) y posteriormente el cADN es amplificado para obtener una gran cantidad de copias especificas del virus.
El progreso de la amplificación es monitoreado ciclo por ciclo. Los datos se registra desde los primeros ciclos de reacción hasta el último. Por lo tanto, es posible ver la amplificación en tiempo real. Por esta razón se le dio el nombre de PCR en tiempo real.
La detección de la amplificación del material genético es específica y monitoreada mediante la captación de señales de fluorescencia emitida durante los ciclos de la PCR. La presencia de altas concentraciones de material genético evidencia un incremento en la fluorescencia en los primeros ciclos de la reacción. Por el contrario, bajas concentraciones permiten obtener un incremento de fluorescencia en los últimos ciclos de amplificación.
Herramientas para el diagnóstico molecular de la influenza
Para identificar molecularmente al virus de influenza por RT-PCR en tiempo real se requiere de los siguientes elementos:
- ARN del virus extraído de exudado faríngeo, nasofaríngeo y biopsia de pulmón de pacientes en la fase aguda de la infección.
- Cebadores, fragmento de ADN que sirve como punto de partida para la replicación y que son específicos para identificar los diferentes tipos y subtipos del virus de influenza. Se necesita un par de cebadores (sentido y antisentido) para cada tipo y subtipo.
- Enzima retrotranscriptasa que convierte el ARN en cADN.
- Enzima polimerasa que produce la cadena complementaria del material genético buscado (templado).
- Buffer, contiene sales que estabilizan la mezcla de reacción y son sustrato de la polimerasa.
- Sondas marcadas con fluorescencia para para identificar los diferentes tipos y subtipos de virus de influenza, que permitirán observar la amplificación ciclo por ciclo.
- Controles positivos (ARN específico de influenza A y B, y los subtipos).
- Termociclador, equipo con capacidad de calentar y enfriar rápidamente.
Todos estos reactivos conforman una mezcla de reacción que se coloca en el termociclador para llevar a cabo la PCR. Este proceso consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten hasta 45 veces, llamados ciclos. El proceso consiste principalmente en tres etapas: desnaturalización del material genético (95°C), alineamiento de los cebadores (50°) y la extensión (70°). En esta última se genera la cadena complementaria del templado.
Para la PCR en tiempo real es necesario contar con un módulo óptico. Este incide sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada. Asimismo, detecta la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado que está en la sonda.
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Rango reportable del ensayo
Los valores de amplificación se expresa en valores de Ct (del inglés Cycle Threshold). Un Ct es el ciclo a partir del cual los valores de fluorescencia relativa (UFR) rebasan el punto de corte o umbral y es inversamente proporcional a la cantidad de ARN o ADN. La amplificación se observa como una curva sigmoide.
Esta RT-PCR se realiza con varios pares de cebadores para poder identificar los diferentes tipos de influenza, los posibles resultados obtenidos al finalizar el proceso son:
- Influenza A(H1N1)pdm09
- Influenza AH1 Estacional
- Influenza AH3 Estacional
- Influenza A N/S (N/S: No Subtipificable, aquellas muestras negativas para AH1, AH3 y A(H1N1)pdm09
- Influenza B Linaje Yamagata
- Influenza B Linaje Victoria
- Influenza B N/S (N/S: No Subtipificable, aquellas muestras negativas para los linajes Yamagata y Victoria)
- Negativo
- Muestra Inadecuada (lo que significa que la muestra no se recolectó adecuadamente)
Este ensayo es particularmente útil ya que debido a su rapidez y sensibilidad identifica infecciones causadas por este virus como causa de brotes. Un resultado positivo en zonas delimitadas o instituciones puede respaldar la decisión de implementar de inmediato medidas de prevención y control para brotes de influenza.
Un RT-PCR en tiempo real no solo identifica al virus de influenza que se encuentra en circulación. También podría identificar nuevos virus de la influenza, de los cuales no se pudo identificar ningún subtipo de los mencionados anteriormente.
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Fuentes
Secretaría de salud. (2019). Boletín Epidemiológico Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica Sistema Único de Información. Recuperado, de DGE Sitio web: https://www.gob.mx/salud/acciones-y-programas/direccion-general-de-epidemiologia-boletin-epidemiologico
CDC. (2019). Información sobre pruebas moleculares rápidas, RT-PCR y otras pruebas moleculares para el diagnóstico de infección por el virus de la influenza. Recuperado, de CDC Sitio web: https://espanol.cdc.gov/enes/flu/professionals/diagnosis/molecular-assays.htm
CDC. (2019). Síntomas de la influenza y sus complicaciones. Recuperado, de CDC Sitio web: INFLUENZa.rhove.gob.mx/influenza/
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