Diagnóstico de la influenza: enfoques actuales para el diagnóstico del virus de la influenza

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Diagnóstico de la influenza

A pesar del avance significativo en la investigación sobre el virus de la influenza y la vacunación, la enfermedad sigue siendo un preocupante tema de salud pública. El diagnóstico preciso y temprano es fundamental para el inicio rápido de la terapia antiviral. El oportuno diagnóstico de la influenza permite reducir la morbilidad y la mortalidad, tanto en epidemias estacionales como en pandemias.

Los signos y síntomas de la influenza pueden variar según edad, estado inmunológico y medicación debido a condiciones de salud subyacentes.

La influenza no complicada puede incluir cualquiera o todos los signos y síntomas comunes de la enfermedad:

  • Fiebre
  • Dolor muscular generalizado
  • Dolor de cabeza
  • Falta de energía
  • Tos seca
  • Dolor de garganta
  • Congestión nasal
  • Secreción nasal (ocasionalmente)

Diagnóstico de la influenza: paciente con signos y síntomas de infección respiratoria

Es especialmente relevante que la fiebre no siempre está presente en pacientes con influenza. Esto es más frecuente en adultos mayores. La fiebre y dolores corporales pueden durar de tres a cinco días. De la misma manera, la falta de energía puede durar dos semanas o más, en especial en personas de la tercera edad.

El diagnóstico de la influenza puede ser difícil de realizar basándose solo en signos y síntomas clínicos. Esto debido a que los síntomas pueden ser muy similares a los causados por otros agentes infecciosos. Por ejemplo:

  • Mycoplasma pneumoniae
  • Adenovirus
  • Virus respiratorios sincitiales
  • Rinovirus
  • Virus parainfluenza
  • Legionella spp

Cómo se realiza el diagnóstico de la influenza

Actualmente se dispone de varios enfoques para el diagnóstico de infecciones del virus de la influenza en humanos. Los principales enfoques para el diagnóstico de la influenza incluyen:

Actualmente se está desarrollando nuevos métodos de diagnóstico para superar las limitaciones asociadas con algunos métodos de detección convencionales. Este artículo expone los diferentes enfoques de diagnóstico de la influenza disponibles para la detección del virus en humanos.

La sensibilidad y especificidad de cualquier prueba de influenza puede variar. Esto depende del laboratorio que realiza la prueba, el tipo de prueba aplicada, el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la recolección de la muestra y el tipo de muestra analizada.

Cultivo celular

La recuperación del virus de la influenza en muestras clínicas por propagación en células de mamíferos o huevos embrionados es el método convencional para el diagnóstico de la influenza. Introducido en la década de 1940, el enfoque de cultivo celular se considera el estándar de oro en el diagnóstico de infecciones virales. Este enfoque consiste en la inoculación de líneas celulares permisivas o huevos embrionados con muestras infecciosas. Además de la propagación de siete a 10 días para monitorear el desarrollo del efecto citopático y la confirmación final de la infección. Esto mediante la coloración de anticuerpos específicos, la hemadsorción con eritrocitos o la microscopía de inmunofluorescencia.

El aislamiento del virus de la influenza con este enfoque se realiza generalmente en líneas celulares establecidas. Estas líneas celulares establecidas son las siguientes:

  • Riñón Canino Madin Darby (MDCK)
  • A549, células humanas de epitelio alveolar basal
  • Riñón de mono rhesus (LLC-MK2)
  • Riñón de mono verde búfalo (BGMK)
  • Células epiteliales de pulmón de visón (Mv1Lu)

Asimismo, el aislamiento puede realizarse en líneas celulares primarias como:

  • Células de riñón de mono rhesus (RhMK)
  • Riñón de mono verde africano (AGMK)

En algunos laboratorios el cultivo celular se usa en paralelo con las pruebas de amplificación de ácido nucleico.

Diagnóstico de la influenza: cultivo celular

Cultivo celular para el diagnóstico de influenza

Cultivo en shell vial

El cultivo en shell vial (SVC) es otro enfoque de cultivo celular. Este se ha utilizado desde principio de la década de 1990 para el diagnóstico de la influenza. El SVC implica la propagación de virus en células de mamíferos cultivadas en viales (frascos) pequeños de 1 dram. Posteriormente se lleva a cabo una coloración con anticuerpos monoclonales fluorescentes específicos del virus de la influenza. El cultivo en shell vial es relativamente sencillo y más sensible en comparación con el método de aislamiento viral tradicional. Además, la detección viral es posible dentro de 24 a 48 horas.

Un método modificado de cultivo en shell vial que utiliza células R-mix (mezcla de células de pulmón de visón y células de adenocarcinoma humano) ha demostrado una mayor sensibilidad en comparación con el enfoque de cultivo en shell vial con un tiempo de respuesta de aproximadamente 1.4 días.

Prueba de inmunofluorescencia directa (DFA)

La prueba de inmunofluorescencia directa (DFA, por sus siglas en inglés), también conocida como prueba de anticuerpos fluorescentes directos, es un análisis basado en antígenos. Se emplea como prueba de rutina para el diagnóstico de infecciones por el virus de la influenza. Este enfoque implica la coloración directa de células epiteliales respiratorias. Tales células se derivan de hisopos nasofaríngeos o aspirados nasofaríngeos con anticuerpos específicos del virus marcados con fluorescencia. Posteriormente, se examina bajo un microscopio de fluorescencia.

Debido a la simplicidad del procedimiento y al corto tiempo de respuesta, las pruebas de inmunofluorescencia directa se utiliza con frecuencia para el diagnóstico de la influenza. Actualmente hay dos pruebas de DFA disponibles en el mercado, aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA).

Es especialmente relevante que estas pruebas están destinadas principalmente a la detección y diferenciación de los virus de influenza A y B. Sin embargo, no son útiles para la subordinación del virus de influenza A.

Diagnóstico de la influenza: inmunofluorecencia

La inmunofluorescencia es una técnica de inmunomarcación que hace uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada molécula

Pruebas serológicas

Los análisis de sangre son otro método para el diagnóstico de la influenza. Las pruebas más comunes utilizadas para detectar las respuestas de anticuerpos específicos del virus de la influenza son las siguientes:

Prueba de inhibición de la hemaglutinación (HAI)

Las pruebas de hemaglutinación son el método más común para determinar la presencia de anticuerpos específicos contra el virus de la influenza en el suero. Esto después de la infección natural o vacunación en humanos y otros modelos animales.

Aunque este ensayo es simple y económico, su sensibilidad para la identificación de los virus de la influenza aviar A, especialmente del subtipo H5N1, ha demostrado ser pobre. Por lo tanto, esto limita su utilidad para el diagnóstico de la influenza.

Prueba de microneutralización o neutralización de virus (VNT)

La prueba de neutralización de virus es otra técnica utilizada para medir la inducción de anticuerpos específicos de virus después de una infección. Se usa de manera rutinaria para la detección de títulos de anticuerpos de cepas de virus de influenza estacional o de la gripe aviar.

Este enfoque se basa en la capacidad de los anticuerpos específicos del virus para neutralizar el virus de la influenza, evitando así la infección viral de las células.

Aunque este método es más sensible en comparación con el anterior, su aplicación para el diagnóstico de rutina está restringida. Esto se debe a la necesidad de usar virus infecciosos en los laboratorios certificados BSL2 y BSL3.

Hemólisis radial simple (SRH)

La hemólisis radial es una técnica utilizada para determinar la inducción de anticuerpos luego de una infección natural o por vacunación. Se utiliza para medir la hemólisis mediada por complemento inducida por antígenos y anticuerpos complejos. La SRH se considera más sensible que la prueba HAI y no requiere un tratamiento previo del suero para inactivar los inhibidores no específicos.

Prueba de fijación del complemento

Se trata de un enfoque basado en la inmunodifusión para medir la respuesta de anticuerpos a las proteínas internas del virus de la influenza, después de la vacunación o la infección. Debido a su menor sensibilidad, la fijación del complemento ha sido reemplazada por otros análisis.

Diagnóstico de la influenza: prueba ELISA

El ELISA de captura de antígenos es utilizado en múltiples formatos a nivel mundial para la detección rápida de la influenza A

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Las pruebas basadas en ELISA están disponibles en formato de placa de microtitulación sólida o en formato de tira de papel. Se ha utilizado estás pruebas desde principios de la década de 1990 y han demostrado una alta sensibilidad y especificidad.

En la actualidad se encuentran disponibles varias pruebas ELISA aprobadas por la FDA para el diagnóstico de infecciones virales y bacterianas. Aunque se ha usado las pruebas basadas en ELISA por algún tiempo, una limitación importante es la menor sensibilidad en comparación con pruebas basadas en ácido nucleico (NAT).

Pruebas de diagnóstico rápido de influenza (RIDT)

Las RIDT son pruebas basadas en antígenos, desarrolladas para el diagnóstico rápido de infecciones por el virus de la influenza. Estas pruebas utilizan anticuerpos monoclonales que se dirigen a la nucleoproteína viral y emplean inmunoensayos enzimáticos o técnicas inmunocromatográficas (flujo lateral). Las pruebas de diagnóstico rápido de influenza están disponibles en tiras reactivas, casetes o formatos de tarjeta. Las RIDT se puede completar en menos de 30 minutos, con los resultados observados visualmente en función de un cambio de color u otras señales ópticas.

Debido a la simplicidad de uso y la velocidad de obtención de resultados de los análisis, es muy común el uso de estas pruebas para el diagnóstico de la influenza.

Actualmente, varias RIDT aprobadas por la FDA están disponibles en el mercado. La mayoría de estas pruebas puede detectar los virus de la influenza A o B, pero no puede distinguir entre la influenza A y B.

Diagnóstico de la influenza: PCR múltiple

Pruebas basadas en ácido nucleico (NAT por sus siglas en inglés)

El desarrollo de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por Kary Mullis en 1983 revolucionó el campo del diagnóstico de enfermedades infecciosas. Las pruebas de ácido nucleico (también conocidas como NAT) se basan en la PCR. Su función es la detección de secuencias de ADN o ARN específicas de virus, en lugar de antígenos virales o anticuerpos. Estas pruebas son mucho más sensibles en comparación con las pruebas serológicas basadas en antígenos y pueden detectar un virus en menos tiempo. Existe una variedad de pruebas disponibles basadas en ácido nucleico que se utiliza para el diagnóstico de la influenza.

Las pruebas para el diagnóstico de la influenza basadas en ácido nucleico son las siguientes:

  • PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR)
  • Reacción en cadena de la ligasa (LCR)
  • Pruebas basadas en secuenciación (incluida la secuenciación de próxima generación, NGS)
  • Análisis de micromatrices de ADN
  • Amplificación basada en secuenciación de ácido nucleico (NASBA)
  • Técnica de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)
  • Ensayo basado en la amplificación simple (SAMBA)
  • Amplificación mediada por transcripción
  • Amplificación por desplazamiento de cadena

La mayoría de estas pruebas tarda en arrojar resultados de dos a cuatro horas. Por lo general, las pruebas NAT tienen una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con las pruebas basadas en antígenos. Actualmente hay 21 pruebas disponibles basadas en ácido nucleico con aprobación de la FDA para el diagnóstico de la influenza.

Reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR)

La RT-PCR es el enfoque NAT más tradicional y poderoso para la identificación del virus de la influenza en la mayoría de laboratorios de diagnóstico. La RT-PCR implica tres pasos esenciales:

  • Extracción de ARN viral de muestras clínicas
  • Transcripción inversa de ARN viral a un ADNc monocatenario utilizando la enzima transcriptasa inversa
  • Amplificación del producto de PCR se acopla a la detección fluorescente de productos PCR marcados

Diagnóstico de la influenza: virus de la influenza

Diagnóstico sindrómico de la influenza

Existe una prueba de diagnóstico molecular rápida y precisa para el diagnóstico sindrómico de la influenza. Esta prueba requiere realizar una amplia agrupación de patógenos probables causantes de la infección, enfocados por un síndrome. Un síndrome es un conjunto de signos y síntomas que se relacionan entre sí y con una enfermedad o trastorno particular.

La prueba única para el diagnóstico de la influenza rápido funciona a través de un sistema de PCR multiplex certificado por la FDA. Tal sistema integra la preparación de muestras, amplificación, detección y análisis. Requiere de solo dos minutos de aplicación, con un tiempo total de ejecución de aproximadamente una hora. Después de 60 minutos, se obtiene resultados rápidos que contribuyen a mejorar el tratamiento del paciente.

A través del panel respiratorio del sistema PCR multiplex, se busca identificar a los patógenos causantes de una enfermedad infecciosa respiratoria. Esto incluye los virus de la influenza A, influenza A/H1, influenza A/H1-2009, influenza A/H3 e influenza B.

El diagnóstico temprano de la influenza puede reducir el uso inadecuado de antibióticos y permitir el uso de la terapia antiviral. Sin embargo, debido a que ciertas infecciones bacterianas pueden producir síntomas similares, estas deben considerarse y tratarse adecuadamente. Una coinfección bacteriana puede ocurrir como una complicación de la influenza.

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Fuentes

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